장(腸)내 염증 진단 스마트 미생물 기술 개발
생명과학 / Bio통신원
KRIBB (2020-10-15)

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- 장내 염증 발생을 형광신호로 알려주는 프로바이오틱스 개발
- 미생물을 이용한 새로운 형태의 질병 진단 및 치료제 개발 가능성 제시

□ 순수 국내연구진이 장내 염증 반응에 의해 생성되는 질산염(NO3-)을 장내미생물이 직접 감지하여 형광신호를 내도록 하는 스마트 미생물 기술을 최초로 개발하였다. 이 기술은 합성생물학을 기반으로 인공유전자회로를 제작하고 이를 프로바이오틱스에 도입하여, 비침습적 염증성 장질환의 진단이 가능하도록 한 것이다. 이 기술은 향후 장내미생물을 이용한 새로운 형태의 진단 및 치료제 개발에 기여를 할 것으로 기대된다.
* 비침습적 진단 : 인체에 고통을 주지 않고 실시하는 진단

ㅇ 한국생명공학연구원(원장 김장성, 이하 생명연) 합성생물학전문연구단 이대희/이승구 박사팀과 실험동물자원센터 황정환 박사팀(교신저자: 황정환/이승구/이대희 박사, 제1저자: 우승균 UST 박사과정)이 수행한 이번 연구는 한국연구재단이 지원하는 바이오·의료기술개발사업(차세대 바이오분야 Korea Bio Grand Challenge사업)의 지원으로 수행되었고, 분석화학 분야의 세계적 저널인 Biosensors & Bioelectronics (IF=10.257) 8월 20일자 온라인 판에 게재되었다. 
(논문명 : A designed whole-cell biosensor for live diagnosis of gut inflammation through nitrate sensing)

□ 연구팀은 산화질소의 최종 산화물인 질산염을 장내 염증 진단의 지표물질로 활용하여 합성생물학 기반의 유전자회로를 개발하였으며, 이를 프로바이오틱스균(Escherichia coli Nissle 1917, EcN)에 도입하여 비침습적 염증 진단이 가능한 스마트 미생물을 개발하였다.

ㅇ 연구팀은 질산염을 감지할 수 있는 유전자회로를 개발하기 위해 장내미생물과에 속한 대장균이 산소가 없는 상태에서 호흡시 질산염을 사용하는 점에 주목하였다. 

ㅇ 대장균이 고유하게 가지고 있는 신호전달계를 사용하여 질산염을 감지할 수 있는 조절인자로 활용하였으며, 감지된 신호를 통해 형광 단백질의 발현을 유도하여, 질산염의 존재 유무를 형광세기로 시각화하여 확인할 수 있는 유전자회로를 개발하였다. 

ㅇ 연구팀은 개발된 유전자회로를 프로바이오틱스 대장균에 도입하여 질산염 감지 스마트 미생물을 제작하였으며, 생체 외(in vitro) 환경에서 스마트 미생물의 최적화 과정을 수행하였다.
 
ㅇ 최적화된 스마트 미생물은 장내 환경과 유사한 뮤신(mucin)이 함유된 혐기성 배지 조건에서도 질산염을 성공적으로 감지할 수 있었다. 특히, 혐기 호흡 시 질산염 외에 사용 가능한 다른 전자 수용체들을 대상으로 기질 특이성 실험을 진행한 결과 질산염에 대한 높은 특이성을 나타내는 것을 확인하였다. 

ㅇ 개발된 스마트 미생물을 활용하여 대장염(colitis)을 앓는 실험동물 마우스에서 장내 염증 감지 실험을 수행한 결과, 건강한 마우스 그룹에 비해 염증이 유도된 마우스 그룹에서 질산염 감지 신호에 의한 형광 단백질 발현이 증가된 것을 확인하였다. 특히, 염증 진행 정도에 따른 대장 내 질산염 농도 증가와 대장 및 분변 샘플에서 분석한 바이오센서 내 형광 단백질 발현 증가 경향이 높은 유사성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

ㅇ 다시 말해, 대장 내 염증은 질산염의 생성을 증가시키고, 경구로 주입된 스마트 미생물은 대장에서 염증 반응에 의해 증가된 질산염을 감지하여 형광 단백질을 발현함으로써 대장 및 분변 시료에서의 형광 세기 분석만으로도 대장 내 염증을 진단할 수 있다.

ㅇ 또한, 진단의 특이성(specificity)은 높이고 위양성(false-positive) 결과를 낮추기 위해 염증의 두 지표물질인 질산염(nitrate) 및 티오황산(thiosulfate)이 모두 존재하는 환경에서만 형광 단백질이 발현되는 유전자회로를 개발하였다. 

□ 연구책임자인 이대희 박사는 “장내 염증의 지표물질인 질산염과 티오황산을 동시에 감지하여 형광을 띄는 스마트 미생물을 활용하여 비침습적 염증성 장질환 진단 기술도 개발이 가능하며, 특히 형광 단백질을 염증을 치료할 수 있는 치료제로 대체할 경우 염증과 동시에 치료도 가능한 스마트 미생물 기술도 개발 가능하다”고 밝혔다.

연구결과 개요

□ 연구배경
○ 서구화된 식습관 및 면역학적, 유전적인 요인들에 의해 궤양성 대장염과 같은 대장에 일어나는 염증성 장질환의 발병 빈도가 급격하게 증가되고 있다. 궤양성 대장염을 진단할 수 있는 방법에는 대장 내시경, 분변 검사, 혈액 검사, 컴퓨터단층촬영(CT), 자기공명영상(MRI) 등이 존재하지만 높은 검사 비용 및 불편성 등의 이유로 접근성이 높지 않은 단점이 있다.
○ 염증성 장질환의 경우 조기 진단 및 치료에 대한 중요성이 부각되고 반복되는 염증 반응은 돌연변이를 유발해 암으로 악화되기도 한다. 염증성 장질환 환자의 경우 일반인보다 대장암 발병 위험이 최대 10배 높다는 보고도 있다.  
○ 합성생물학 기반의 인공유전자회로를 이용하여 메타지놈(metagenome)에서의 신규 효소 발굴 및 활성이 개량된 효소의 초고속 탐색(high-throughput screening)과 같은 연구들이 많이 수행되어 왔다. 최근, 인공유전자회로를 이용한 연구 범위가 확대되어 질병의 진단 및 치료를 목적으로 많은 연구들이 수행되고 있으나 아직은 미미한 실정이다. 본 연구에선 장내 질산염 감지를 통한 비침습적 염증 진단 스마트 미생물을 개발하고 이를 실제 대장염 동물에 도입하여 적용 가능성을 확인하였다.
○ 염증의 지표물질로 인터페론 감마(interferon-γ)와 같은 사이토카인(cytokine)의 자극에 의해 활성화된 대식세포(macrophage)를 포함한 여러 체내 세포들에 의해 만들어지는 산화질소(NO)가 활용될 수 있음이 보고되어 왔다.
○ 하지만, 산화질소의 경우 가스 형태로 반감기가 짧고 쉽게 산화물로 전환되는 단점을 가지고 있다. 본 연구에선 산화질소의 최종 산화물인 질산염을 장내 염증 지표물질로 활용하여 질산염 감지 인공유전자회로를 개발하고 이를 프로바이오틱스 대장균에 도입하여 스마트 미생물을 개발하였다.

□ 연구내용
○ 연구팀은 인공유전자회로가 탑재된 스마트 미생물이 질산염 감지를 통해 비침습적으로 염증을 진단할 수 있음을 대장염 동물모델 적용을 통해 최초로 규명하였다.
○ 이 연구에서 연구팀은 대장균 유래의 two-component system(TCS)인 narX 및 narL 유전자를 활용하여 질산염의 존재 유무를 형광 단백질 발현을 통해 확인할 수 있는 인공유전자회로를 개발하였다.
○ 정상적인 조건에서 유전자회로의 형광 단백질은 발현되지 않지만, 염증 반응에 의해 질산염이 과량 생성된 상태에서는 인공유전자회로 내 조절인자인 narX 및 narL에 의해 감지되고 감지된 신호는 형광 단백질 발현을 유도하여 스마트 미생물 내 형광 단백질의 양이 증가되어 강한 형광을 띄게 된다.
○ 생체 외(in vitro) 환경에서 조절인자인 narXL의 발현을 조절하여 스마트 미생물의 구동을 최적화한 결과 조절인자를 항시 발현하는 프로모터(promoter)의 세기가 약할수록 감도(sensitivity)가 향상되는 결과를 확인할 수 있었다.
○ 최적화된 스마트 미생물을 이용하여 장내 환경을 모사한 환경에서의 질산염 감지 실험을 수행한 결과, 장 점막에서 분비되는 뮤신(mucin)이 함유된 혐기성 조건에서도 질산염을 선택적으로 감지할 수 있음을 확인하였다.
○ 최종 개발된 스마트 미생물을 이용하여 실제 dextran sulfate sodium(DSS)로 유도된 대장염(colitis) 실험동물에서 장내 염증 감지 실험을 수행한 결과, DSS를 처리하지 않은 건강한 마우스 그룹에 비해 DSS를 처리하여 염증이 유도된 마우스 그룹에서 질산염 감지 신호에 의한 형광 단백질 발현이 증가된 것을 확인하였다. 특히, 염증 진행 정도에 따른 대장 내 질산염 농도 증가와 대장 및 분변 시료에서 분석한 스마트 미생물 내 형광 단백질 발현 증가 경향이 높은 유사성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
○ 즉, 본 연구의 성과는 대장 내 염증 반응에 의해 증가된 질산염은 염증의 지표물질로 활용할 수 있고, 경구로 주입된 스마트 미생물은 대장에서 질산염을 선택적으로 감지하여 감지된 신호를 통해 형광 단백질을 발현함으로써 대장 및 분변 시료에서의 바이오센서 내 형광 단백질 분석만으로도 대장 내 염증을 진단할 수 있음을 확인한 것이다. 
○ 또한, 진단의 특이성(specificity)은 높이고 위양성(false-positive) 결과를 낮추기 위해 염증의 두 지표물질인 질산염(nitrate) 및 티오황산(thiosulfate)이 모두 존재하는 환경에서만 형광 단백질이 발현되는 합성생물학 기반의 논리회로 를 개발하였으며, 향후 스마트 미생물을 활용한 다양한 질병의 진단 및 치료 적용 가능성을 제시하고 있다.

□ 연구성과의 의미
▶ 합성생물학 기반의 질병 진단 스마트 미생물 개발 
   : 장내 염증 질환의 진단 연구 활용 
○ 본 연구를 통해 개발된 스마트 미생물을 활용하여 염증 발생에 따른 특이적 지표물질인 질산염을 감지함으로써 비침습적 장내 염증 진단 방법으로 활용 가능성을 확인하였다. 기 개발된 스마트 미생물의 인공유전자회로를 크리스퍼유전자가위(CRISPR) 기술과의 접목을 통해 염증 감지 신호를 장기간 기억할 수 있는 기억장치(memory) 개발에도 활용할 수 있을 것으로 예상된다.
○ 스마트 미생물을 활용하여 염증 질환뿐만 아니라 소화기 계통의 다양한 질환의 진단 방법 개발에도 적용할 수 있을 것으로 기대된다.       

▶ 합성생물학 기반의 질병의 진단과 치료가 동시에 가능한 스마트 미생물 개발 
   : 장내 염증 질환의 진단 및 치료제 개발 연구 활용
○ 본 연구에선 질산염 감지 신호를 형광단백질 발현으로 전환하여 진단에 활용하였지만, 형광단백질을 대체하여 다양한 염증 질환 치료용 단백질/대사물질을 발현하여 진단과 동시에 치료가 가능한 스마트 미생물 개발이 가능하다. 기존에 사용되는 항염증 약물들은 복용 시 위장 장애를 일으키거나 약물 효과를 높이기 위해선 과량의 약물을 복용해야 하는 등의 문제점이 있지만, 스마트 미생물 기반의 진단/치료를 활용한다면 염증이 발생한 특정 부위에서의 감지 신호를 통해 염증 치료제를 생산함으로써 부작용은 줄이고 치료 효과는 극대화시킬 수 있을 것으로 기대된다.
○ 스마트 미생물을 활용하여 염증 질환뿐만 아니라 소화기 계통의 다양한 비난치성 질환의 치료제 개발에도 활용가치가 클 것으로 예상된다.

 

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 그림 1. 장내 염증과 질산염 발생의 관계 및 질산염 감지 인공유전자회로
(A) 장내 염증 발생과 질산염 발생의 관계도
(B) 질산염 감지 인공유전자회로 모식도
(C) 유전자회로 발현 플라스미드 사이의 특성 비교
(D) 전사조절인자를 발현하는 항시 발현 프로모터 세기에 따른 특성 비교
(E) 유세포 분석을 통한 단일 세포 수준에서의 질산염 농도에 따른 인공유전자회로의 특성 비교
(F) 공초점 레이저 주사 현미경을 통한 단일 세포 수준에서의 질산염 유무에
따른 인공유전자회로의 특성 비교

 

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그림 2. 장내 환경을 모사한 조건에서의 질산염 감지 인공유전자회로 특성 분석
(A) 글리세롤(glycerol) 혹은 뮤신이 첨가된 혐기성 배지 조건에서의 질산염 유무에 따른 dlsrhd유전자회로 특성 비교
(B) 유세포 분석을 통한 단일 세포 수준에서의 질산염 농도에 따른 인공유전자회로 특성 비교
(C) 질산염을 포함한 다양한 최종 전자 수용체들에 대한 기질 특이성 분석
(D) 공초점 레이저 주사 현미경을 통한 단일 세포 수준에서의 질산염 유무에
따른 인공유전자회로의 특성 비교

 

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그림 3. DSS처리 기간에 따른 염증 발생, 질산염 농도 및 스마트 미생물의 형광 분석
(A) DSS처리 기간에 따른 실험 그룹
(B) 몸무게 감소 변화
(C) 인터루킨-6(interleukin-6)의 증가 변화
(D) 대장 조직 절편의 hematoxylin and eosin (H&E) 염색 결과
(E) 대장 조직 절편의 조직·병리학적 병변 증가 변화
(F) 대장 샘플에서의 질산염 농도 증가 변화
(G) 대장 샘플에서의 스마트 미생물의 형광단백질 증가 변화
(H) 형광 현미경을 통한 대장 조직 절편 내 활성화된 스마트 미생물 확인


 

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그림 4. 논리회로 기반의 질산염과 티오황산 동시 감지 인공유전자회로
(A) 논리회로 기반의 인공유전자회로 모식도
(B) 논리회로 기반의 인공유전자회로를 활용한 염증 지표물질 감지 특성 분석

정보출처: BRIC 바이오통신원
<본 기사는 기관에서 작성된 보도자료 또는 개인에 의해 작성 되었습니다.>
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