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2019년부터 시작된 코로나바이러스 대 유행 이후, 바이러스 치료제와 백신 개발을 위해 다양한 연구와 실험이 수행되어 왔습니다. Molecular Devices 에서는 관련 연구를 수행하시는 선생님들께서, 호흡기 바이러스의 감염 메커니즘부터, 중화항체, Antibody binding Assay, Viral IgG Titer Assay등 치료제 개발에 이르는 다양한 연구 과제를 보다 빠르고 효율적으로 수행할 수 있도록, High Content Imaging 과 Microplate Reader 기반의 실험방법을 소개해드리고자 합니다.
특히 Mayo Clinic 등에서 실제로 활용하여 성과로 나타낸 이미지 기반의 분석기술 뿐 아니라, 항체 개발에 필요한 Viral IgG 를 FP (Fluorescence polarization) 를 활용하여 효과적으로 적정하는 방법 등을 소개해 드릴 것입니다.

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Modulating signaling pathways including Wnt and Hippo can induce cardiomyocyte proliferation in vivo. Applying these signaling modulators to human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) in vitro can expand CMs modestly (<5-fold). Here, we demonstrate massive expansion of hiPSC-CMs in vitro (i.e., 100- to 250-fold) by glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) inhibition using CHIR99021 and concurrent removal of cell-cell contact. We show that GSK-3β inhibition suppresses CM maturation, while contact removal prevents CMs from cell cycle exit. Remarkably, contact removal enabled 10 to 25 times greater expansion beyond GSK-3β inhibition alone. Mechanistically, persistent CM proliferation required both LEF/TCF activity and AKT phosphorylation but was independent from yes-associated protein (YAP) signaling. Engineered heart tissues from expanded hiPSC-CMs showed comparable contractility to those from unexpanded hiPSC-CMs, demonstrating uncompromised cellular functionality after expansion. In summary, we uncovered a molecular interplay that enables massive hiPSC-CM expansion for large-scale drug screening and tissue engineering applications.

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엑소좀/EV (exosome, extracellular vesicles/EV)은 대다수의 세포가 분비하는 30-1000 nm 크기의 지질 이중층의 세포밖 소포체입니다. 엑소좀/EV는 세포의 성장, 이동 및 면역 세포 조절과 같은 활성을 가지고 있고, 세포에서 매우 소량 분비가 되지만, 표적 세포에 작용하는 활성이 단일 물질에 비해 수십 내지 수백배 크기 때문에, 다양한 치료, 약물전달 및 화장품과 같은 응용분야에서 ‘비세포성’ 치료 물질로 활용될 수 있습니다. 현재까지, 엑소좀/EV를 분리하기 위해서 초고속원심분리 방법이 주로 사용되고 있으며, 이 외에도 침전법, 크로마토그래피, 음향, aqueous two-phase 등이 사용되고 있지만, 순도 높은 엑소좀/EV 만을 분리하는 것은 아직 어려운 실정입니다. 더욱이 엑소좀/EV의 실제 성분 (막 단백질 및 EV 내부 단백질)에 대한 고찰 없이 분리를 수행할 경우, 비소포체 유래 물질이 같이 분리되기 때문에 오염 물질들에 의한 활성 변화와 같은 잘못된 결과가 도출될 수 있습니다.

EVpedia (http://evpedia.info) 데이터베이스에서 기존에 보고된 엑소좀/EV 프로테옴 분석 결과, 생성에 관련된 세포막, 세포질, 엔도좀 유래 단백질들 이외에도, 다른 세포내 소기관 (핵, 미토콘드리아, 세포내 소포체) 유래 단백질들이 높은 빈도로 관찰됨을 확인했습니다. 이 단백질들이 오염 EV 단백질들임을 규명하기 위해, EV 외부에 단백질 분해 효소를 처리해서 영향을 받는 단백질체를 (EV 내부는 지질 이중층 보호에 의해 영항을 받지 않음) 정량 프로테옴 분석을 통해 확인했습니다. 이 결과 실제 EV 단백질들은 주로 세포막 (47%), 세포질 (37%), 세포골격 (8%), 및 세포외 분비 단백질들 (3%) 로부터 유래된 것으로 나타났고, 오염된 비소포체 단백질들은 세포핵, 세포내 소포체, 및 미토콘드리아에서 대부분 유래함을 확인했습니다. 이를 통해실제 EV 단백질들을 비소포체 단백질들로부터 구분 지을 수 있는 방법을 검증했으며, 지금까지 프로테옴 분석에서 확인된 다수의 단백질들이 오염된 것일 수 있다는 것을 보여주고 있습니다. 앞으로, 실제 EV 단백질들을 규명하는 것은, EV 단백질의 선택적 분비 과정을 이해하고, 안정성 있는 치료 및 응용 물질로 활용되기 위한 필수적인 단계가 될 것 입니다.

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면역항암제의 바이오마커로 조직종양변이 부담 (TMB, Tumor Mutation Burden)의 가능성이 대두되고 있습니다. 하지만 높은 TMB에도 불구하고 면역항암제에 반응하지 않는 환자들이 많아 TMB가 실제 임상에서는 아직 쓰이지 못하고 있습니다.
본 연구에서는 암세포 진화 (Tumor evolution)하는 과정에서 암세포가 잠재적인 면역원성을 최소화하기 위해 HLA 대립유전자의 LOH (loss of heterozygosity)를 획득한다는 사실에 기반하여 HLA 대립유전자의 LOH를 고려하여 TMB를 새롭게 계산하는 방법 (HLA-corrected TMB)을 고안하였습니다. 본 세미나에서는 HLA-corrected TMB가 지니는 임상적 유용성과 최근에 진행되고 있는 면역항암제 관련 연구들에 대해 말씀드리고자 합니다.

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우리 몸은 세포증식과 세포사멸의 균형을 통해 조직과 기관의 크기를 일정하게 유지합니다. 정상 세포는 contact inhibition으로 증식이 억제되는 반면, 암세포는 과밀한 세포 환경에서도 지속적인 증식이 가능합니다. 암세포가 무한증식이 가능한 것은 contact inhibition을 조절하는 Hippo pathway가 원활하게 작동하지 않기 때문입니다. 저희 연구실은 Hippo pathway의 중심인자인 종양억제단백질 ’LATS2’에 단일 당 분자 ’O-GlcNAc’이 부착되었을 때 LATS2의 활성이 저해되는 메커니즘을 규명하였습니다. LATS2의 O-GlcNAc 수식화는 LATS2 활성화에 관여하는 adaptor ‘MOB1’과의 결합을 방해합니다. 그 결과 LATS2의 활성이 저해되어 하위단백질인 전사인자 ‘YAP/TAZ’가 과도하게 활성화되고, YAP/TAZ에 의해 세포증식에 관여하는 유전자의 발현이 증가되어 암세포의 증식이 촉진됩니다. 흥미로운 사실은 YAP/TAZ의 직접적인 저해자로 작동하는 LATS2가 이들 단백질에 의해 발현이 유도된다는 것입니다. 즉, LATS2는 Hippo pathway의 음성피드백루프(negative feedback loop)의 핵심 인자인 것입니다. 따라서 LATS2의 O-GlcNAc 수식화는 Hippo pathway의 지속적인 약화를 유도하여 암의 무한증식에 기여할 것입니다.

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형광 현미경법(Fluorescent microscopy)은 특정 분자의 분포, 양, 세포 내부의 위치 확인뿐만 아니라 colocalization, interaction 등의 연구에 널리 사용되고 있습니다. 이번 웨비나에서는 라이카코리아 이호재 박사가 형광 현미경의 기초부터 형광 현미경 구매 검토 시 고려해야 할 사항, 형광 현미경의 사용법에 대해 소개합니다. Leica Microsystems의 이미징 소프트웨어인 LAS X를 통해 형광 현미경의 기본적인 사용법을 소개하므로, LAS X를 사용하시는 분들뿐만 아니라 형광 현미경 사용 및 사용 예정인 분들에게 도움이 되시길 바랍니다.