Q. transformation할때 재조합이 잘 안 됩니다....
답변 2 | DJdj | 01.25 23:27
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com cell은 x1-blue를 사용하고 vector는 ta-vector을 사용하고 inser DNA는 1000bp정도 입니다. 실험을 계속 하면서 amp LB배지에 배양시 colony가 형성이 되는데 막상 확인을 하면 vector가 재조합이 안 되고 빈 vector만 확인이 됩니다.... 도대체 몇번째 실험을 이제 모르겠습니다.... heat shock이 문제인지 뭐가 문제인지 모르겠습니다. com cell에 vector가 들어가긴 하는데 모두 빈 vector만 들어가니..... 고수, 선배님들의 조언을 부탁드립니다.....
키워드: gene, cloning
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A. 답변 (2)

사용하는 insert 말단에 A가 붙어있다면 ligation 조건을 한번 검토해 보세요.

ligation 후 전기영동으로 확인해 보면 ligation이 잘되는지 확인 가능합니다.

SPEED (2020-01-27 09:22)

T vector는 Taq DNA pol로 증폭한 DNA 만 ligation 됩니다.

Pfu DNA pol 같은 proofreading 기능이 있는 polymerase가  증폭한 DNA는 ligation되지 못합니다. 그래서 Pfu DNA pol로 증폭한 다음 정제하고 dNTP를 넣고 Taq DNA pol을 넣어서 72도시에서 30분 반응시키면 증폭된 DNA 말단에 A가 붙어서 T vector에 ligatin 됩니다.

혹시 이 과정을 다 거쳤는데도 cloning이 안되면 T vector를 의심해야 합니다.

클로닝할때 insert와 T vector를 ligation하는 것과, T vector만 ligation 한 것을 transformation 해 보세요.

만일 두 경우 모두 colony가 유사한 숫자만큼 나오면 T vector가 잘못된 것입니다. T vectro는 self-ligation이 되지 않아야 정상이거든요.

강시 (2020-01-27 11:19)
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<본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, BRIC에서 추가적인 검증과정을 거친 정보가 아님을 밝혀드립니다.>
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