Q. Protein extract 한 cell sample이 lysis가 잘 안된 것 같은데, 개선할 수 있는 방법이 있을까요?
알 dwre (대학원생)  |  2019.12.06 12:46

안녕하세요. 석사과정 중인 학생입니다.

mouse cell에서 western blot을 하기 위해 protein extraction을 하였습니다.

과정은 다음과 같습니다.

1. RIPA buffer를 cell pellet에 분주한 뒤 pipetting한다.

2. 30분간 ice 위에서 incubation

3. 12000rpm, 4oC, centrifuge 

4. 상층액만 저장한다.

이후 western blot을 하였는데, gel 전기영동 후 coomassie 염색을 해보니 50~70kDa 위치에 항상 두껍게 밴드가 뜨고 그 외에는 밴드가 아예 뜨지않았습니다.

이 밴드를 교수님께 보여드렸는데 교수님께서는 cell lysis가 잘 안된 것 같다고 하십니다. 

 

제가 샘플을 새로 만들 수는 없는 상황이라 이 샘플을 살려야합니다.

혹시 현 상황에서 이 샘플을 개선할 수 있는 방법이 있을까요?

다른 정보들을 많이 봐도 조건을 바꿔서 다시 샘플을 만드시더라고요..

저희는 지금 연구실 상황 상 샘플을 다시 만들수는 없어서요..

꼭 답변주시면 감사하겠습니다..ㅠ

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A. 답변 (4)
SPEED  |  2019.12.06 14:15

lysis가 잘안되면 전체적으로 단백질이 연하게 나오며 특정 band만 진하게

나오지는 않습니다.

전기영동에 문제는 없나요?

초음파로 완전히 파쇄한 시료와 RIPA로 lysis한 시료를 단백질 정량을 해보세요.

차이가 많이 나는지..

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안재진  |  2019.12.06 16:18

50~70KDa 라면 FBS의 BSA일것 같다는 생각도 드네요...

배지 제거가 잘 되고 prep이 진행되신건가요?

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dwre  |  2019.12.06 17:32

SPEED님,
좋은 답변 감사드립니다.

전기영동 문제는 아닌 것 같습니다. 
왜냐하면 같은 조건으로 내린 하나의 gel에서 다른 sample들은 band가 잘 내려갔습니다.

초음파로 파쇄한 시료와 RIPA로 lysis한 시료를 비교해보라고 하신 말씀은, 
cell을 다시 준비한 뒤 초음파로 완전히 파쇄해서 만든 시료와 원래 protocol대로 RIPA로 lysis한 시료를 비교하라는 말씀이신가요? 
아니면, 현재 있는 RIPA로 lysis한 시료의 일부를 sonication한 뒤, 단백질 정량 결과값을 비교해보라는 말씀인가요?

같은 protocol로 만든 시료들 내에서도 어떤 시료들은 본문에 쓴 대로 50~70kDa위치에만 밴드가 두껍게 뜨고, 어떤 시료들은 정상적으로 밴드가 잘 내려갔습니다.
이 두 시료의 단백질 정량 값에서는 큰 차이가 없었구요..

현재 가지고 있는 RIPA로 lysis한 시료를 sonication해보는 것은 의미가 없을까요..?

 

 

안재진님, 
좋은 답변 감사드립니다.
안그래도 그 문제에 대해서 걱정이 됐었습니다.
배지 제거가 잘 안된 문제도 있는 것 같습니다.
현재 가지고 있는 sample에서, 개선할 수 있는 방법은 없을까요..? 
샘플을 다시 만들기는 어렵습니다..

 

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SPEED  |  2019.12.06 18:01

- 초음파로 파쇄한 시료와 RIPA로 lysis한 시료를 비교해보라고 하신 말씀은, cell을 다시

준비한 뒤 초음파로 완전히 파쇄해서 만든 시료와 원래 protocol대로 RIPA로 lysis한

시료를 비교하라는 말씀이신가요? 

: 네.. 초음파 파쇄와 비슷한 정도로 단백질이 나오는지 확인해 봐야지 얼마나 lysis가

안되었는지 알수 있을것 같습니다.

- 같은 protocol로 만든 시료들 내에서도 어떤 시료들은 본문에 쓴 대로 50~70kDa위치에만

밴드가 두껍게 뜨고, 어떤 시료들은 정상적으로 밴드가 잘 내려갔습니다.

이 두 시료의 단백질 정량 값에서는 큰 차이가 없었구요..

: 두 시료간에 BSA로 추정되는 단백질의 양차이로 비슷하게 정량값이 나온것이 아닐까

생각이 드네요.

- 현재 가지고 있는 RIPA로 lysis한 시료를 sonication해보는 것은 의미가 없을까요..?

: 이미 원심분리를 안한 상태 같으면 초음파 처리를 하면되고 원심분리를 한 상태면

cell이 없기 때문에 비교 확인은 힘듭니다.

배지에 단백질이 상당히 많기 때문에 cell을 한번 정도 washing하고 lysis시키는 것이

좋습니다.

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<본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, BRIC에서 추가적인 검증과정을 거친 정보가 아님을 밝혀드립니다.>
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