Q. Kanamycin promoter가 뭔가요??
올챙이 김민기96666 (대학원생)  |  2020.12.05 19:26

안녕하세요

제 유전자 벡터의 AmpR gene을 KanR gene으로 교체하는 작업을 하고 있습니다.

KanR gene은 pET-28 vector에서 빼와서 제 유전자 벡터에 넣는데요, 제한효소 잘 잘리고 ligation도 된 것으로 보이는데 Kan 배지에서 도저히 colony가 자라질 않아서..

교수님께서 KanR gene만 넣는게 아니라 promoter를 포함한 cassette를 넣어야 한다, 라고 말씀해주셨는데, 도저히 kanamycin promoter를 찾을수가 없습니다ㅠㅠ

Addgene site에서 pET-28b(+)로 표시되는 plasmid는 KanR promoter가 표시되어있지 않아요.. 표시되어있는 promoter라고는 하나인데, 그나마도 KanR gene과 반대방향입니다. 사실 저는 KanR gene 자체에 promoter가 포함되어있다고 생각했는데, 교수님께서 그럴리 없다고 하셔서.. 도대체 KanR promoter가 뭔가요?? 이것때문에 몇주를 붙들려있습니다 제발 도와주세요ㅠㅠ

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A. 답변 (11)
SPEED  |  2020.12.05 19:37
단백질이 발현되려면 promoter + ORF가 필요합니다.
Kanamycin 부분의 염기서열로 잘라낼 부분을 정해야하고 atg상류 150bp면 충분하지만 정확한 promoter서열이 나와있는 자료가 있습니다.
map에 나와있는 부분은 ORF일겁니다.
따라서 저항성이 안생기는 것이고 제한효소로 자를수
없고 promoter + ORF 부분은 PCR로 얻는것이 좋습니다.
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이누SHY  |  2020.12.07 00:23

제가 보기에도 pET-28b(+) vector 시퀀스를 살펴봤는데 별도의 promoter 표기가 되어있진 않는 것 같습니다.

그렇지만 promoter가 없을 순 없고, 경험상 bacterial promoter는 매우 짧아도 작동하기 때문에 특별히 표기가 안된 것으로 보입니다. T7 promoter 같은 것만 봐도... 19 bp밖에 되지 않기 때문에...

Amp용 promoter를 그대로 가져다가 쓰시거나, 혹은 Kanamycin 앞 쪽에 있는 replication origin sequence 바로 뒤까지 다 통으로 떠서 바꾸는 방법도 하나의 대안이라고 생각이 됩니다.

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SPEED  |  2020.12.07 01:11
실제로 KM gene cloning 안해본것으로 보이는데Kanamycin 앞에 promoter 붙어있습니다.
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김민기96666  |  2020.12.07 16:42

안녕하세요 질문자입니다.

이 내용을 말씀드렸어야 했는데, 마음만 급해서 그냥 올려버렸네요..

Bric에서 KanR cassette가 1.2 kb라는 글을 하나 보았고,

KanMX sequence를 보고, 적당한 크기의 promoter와 terminator를 넣고자 하였습니다. 비록 KanMX의 KanR gene과 pET28b(+)의 KanR gene의 sequence는 매우 달랐지만요..

그래서 pET28b(+)의 KanR 앞 350 bp, 뒤 208bp를 포함한 부분을 제한효소+primer가 되도록 primer를 짜서 PCR한 후 잘라서 ligation을 해보았습니다.

이 때 ligation이 된 것으로 보였지만 저항성이 나타나지 않은 것이구요.

 

AmpR promoter도 잘리기는 했는데.. 제한효소 자리가 애매해서 AmpR promoter를 남기면 AmpR까지 일부 전사-번역 될 것 같아 걱정입니다ㅠㅠ

이 경우..정말 방법이 없을까요..?

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SPEED  |  2020.12.07 17:00

Amp-r gene을 제거하고 KM-r gene을 넣는 것이 좋습니다.

- 이 때 ligation이 된 것으로 보였지만 저항성이 나타나지 않은 것이구요

: 제한 효소로 자른 후 전기영동을 통해 vector에 KM-r gene이 확실히 들어간

것을 확인했나요?

새로운 vector를 자주 만들기 때문에 Amp-r, CM-r, KM-r gene을 자주 사용하는데

pET28이나 다른 vector에 있는 KM-r gene을 PCR로 증폭해서 사용하면 항생제

내성이 나옵니다.

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김민기96666  |  2020.12.07 17:15

안녕하세요. 질문자입니다

AmpR과 kanamycin 모두 double site digestion을 진행하였습니다.

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digestion 된 걸 전기영동 해 본 것은 위와 같습니다.

 

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ligation 했을 때, 8000에서 10000 사이에서 안 보이던 band가 나와서 ligation이 되었다고 생각하였는데, 혹시 제가 잘못 생각한 것일까요?

 

cloning 경험이 별로 없어 많이 부족합니다. 답변해주셔서 정말 감사합니다ㅠㅠ

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SPEED  |  2020.12.07 17:45
cloning은 안된것으로 보입니다.
KM-r gene은 어느 vector에서 어떤 방법으로
준비했나요?
또한 어떤 vector에서 amp-r gene을 어떤 방법으로
잘라내어 KM-r gene을 연결했나요?
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김민기96666  |  2020.12.07 18:18

혹시 cloning이 잘 안 되었다고 생각하신 이유를 여쭤봐도 될까요? 앞으로 제가 판단함에 있어 기준을 어떻게 잡아야 할지에 대해 크게 도움이 될 것 같습니다.

 

KanR은 pET28b vector에서 KanR gene 앞 350 bp, 뒤 208bp를 포함한 부분을 PCR 하여 준비하였는데, primer 끝에 제한효소 자리+residual base를 넣어 design 하였습니다. 그래서 결과적으로

제한효소1-350bp-KanR-208bp-제한효소2

위와 같은 PCR product가 나왔고, 제한효소 두개로 double digestion을 하여 insert를 준비하였습니다.

 

AmpR은 NCBI blast를 돌린 결과 pGEXGSTp65가 가장 먼저 나와서, pGEX vector인 것으로 생각됩니다. Amp promoter upstream에 제한효소1 자리가, Amp gene이 끝날 무렵 즈음에 제한효소2 자리가 있어, 마찬가지로 double digestion 하였습니다.

 

Digestion은 모두 37도씨 o/n으로 진행하였고, gel purification 하여 digested vector와 digested insert를 준비했습니다.

 

그 후 T4 ligase로 16도씨 o/n으로 ligation을 진행하였으며, DH10B 50 uL에 2.5 uL을 transformation 하여 LB/KanR 고체 배지에서 37도씨 o/n으로 키웠으나 colony가 뜨지 않았습니다.

 

혹시 실례가 안 된다면 KanR gene을 처음 cloning하실 때 promoter region을 어떻게 찾으셨는지 여쭤봐도 될까요? 저는 Addgene에서 열심히 찾아보려고 하였으나 찾을 수가 없었습니다..

다시 한 번 답변해주셔서 정말 감사합니다ㅠㅠ

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SPEED  |  2020.12.07 19:02

Amp-r gene cloning을 물은 것은 아니구요.

- AmpR은 NCBI blast를 돌린 결과 pGEXGSTp65가 가장 먼저 나와서,

pGEX vector인 것으로 생각됩니다

: 질문자가 사용하던 vector아닌가요?

blast로 무엇을 확인했다는 것인가요?

보통 질문만 보고 해결할 수있어야 하는데 필요한 내용이 계속 부족해서

찾아 봐야하니 시간이 부족하네요.

다시한번 필요 정보를 요청합니다.

1. KM-r gene 크기가 얼마인가요?

2. KM-r gene을 어떤 vector에 넣었고 어떻게 준비했나요?

3. KM-r gene을 넣은 vector는 어떤 방법으로 배지에서 selection 했나요?

질문은 최대한 자세히 필요한 정보를 제기해야 해결 하기가 쉽습니다.

cloning 확인은 marker, vector cut, insert, vector + insert cut을 동시에 전기영동

해서 확인하는 것이 좋습니다.

 

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김민기96666  |  2020.12.07 20:40

여러 번 확인하시게 하여 죄송합니다ㅠㅠ

아무래도 그림으로 말씀드리는 게 나을 것 같아 그려보았습니다.

upload_image

위 실험 과정대로 했을 때의 gel 사진은 아래와 같습니다.

1. Digested DNA

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2. Ligased DNA

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8,000~10,000 bp에 나오는 band가 ligased DNA band가 아닌건가요?

부디 이번에는 필요한 정보를 모두 말씀드렸기를 빕니다ㅠㅠ

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SPEED  |  2020.12.07 21:17

1. KM+ 배지에 colony가 나왔으면 KM-r gene이 발현된거 아닌가요?

2. 전기영동 결과는 위의 답변에 첨부되어 있는데 동일한걸 다시 첨부했네요.

marker, vector cut, insert, vector + insert cut을 동시에 전기영동 한게 필요하다는

뜻입니다.

3. vector + insert가 5,887bp인데 전기영동에는 안보이네요.

또한 cloning한 vector에서 insert를 떼어내면 4,490bp인데 이것도 안보이네요.

Amp-r gene 제거도 제한효소로 일부 남기고 잘라내면 안되고 완전히 제거하는

것이 좋습니다.

또한 gel elution용 전기영동은 분자량이 정확히 안나오기 때문에 확인용으로

사용하기에 적합하지 않습니다.

따라서 clone을 다시 잘라서 marker, vector cut, insert, vector + insert cut을 동시에

전기영동 해서 비교하는 것이 정상적인 방법입니다.

vector만드는 방법은 어디서 배웠는지 모르겠지만 전통적인 방법은 아닙니다.

vector를 만들려면 ori, selection marker, MCS를 어떻게 준비해서 조립할지를

정한 후 각 단편을 준비해서 연결하면 됩니다.

간단하지만 각 단편을 만드는 것은 반드시 정해진 방법이 없고 편리한 방법을

사용하는 것이 좋습니다.

한번 잘 만들어 놓은 vector는 오랫동안 사용할 수 있기 때문에 한번 만들 때

여러 측면을 고려해서 만드는 것이 좋습니다.

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<본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, BRIC에서 추가적인 검증과정을 거친 정보가 아님을 밝혀드립니다.>
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