Q. cell lysate protease inhibitor
올챙이 가나다라abcd (대학원생)  |  2020.12.03 09:25

안녕하세요 

요즘 궁금한게 많아서 자주 질문을 올리게되네요.

제가 조골세포를 이용해 ALP 활성을 측정하려고 하는데 세포 추출과정에서 Detergent로 Triton-X 100만 사용하고 있습니다.

그런데 western blot을 할때는 RIPA buffer에 protease와 phosphatase inhibitor 까지 넣어서 단백질이 degraditon되는걸 막아주는데 ALP 측정이나 다른 실험할때는 굳이 protease inhibitor를 넣어줄 필요는 없나요? 

넣어줄 필요가 없다면 그러한 이유는 뭔가요? western blot의 경우 degration 되는걸 방지하고 많은양의 단백질을 얻기 위해서인거 같은데... 

정확한 답변부탁드리겠습니다.! 고수님들! 

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A. 답변 (8)
SPEED  |  2020.12.03 09:59
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단백질 양을 확인하는 wertern에는 protease inhibitor를, phospho-form을 확인하는

western에는 phosphatase inhibitor를 넣는 것이 만에 하나 분해될 가능성을

방지하여 정확한 결과를 얻을 수 있습니다. 

활성측정의 경우 단백질 분해 만 억제하면 될 것 같습니다.

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가나다라abcd  |  2020.12.03 10:08

speed님 답변 감사합니다.

그럼 ALP activity를 측정할때는 굳이 protease를 넣어줄 필요는 없다는 말씀이시네요?

그런데 넣어도 무방하긴 한거죠?

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SPEED  |  2020.12.03 10:10
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단백질(ALP) 분해를 억제해야 하기 때문에 넣는것이 좋습니다.

또한 buffer를 사용하고 triton x-100은 활성에 방해를 주지 않나요?

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가나다라abcd  |  2020.12.03 13:32

넣어야 하는게 좋군요..

triton x가 활성에 미치는 영향은 잘 모르겠습니다.

근데 detergent로 작용해야 하기 때문에 필수로 넣어줘야 하는거 아닌가요? triton x 100 말고 다른 계면활성제를 사용해야 하나요?

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SPEED  |  2020.12.03 13:38

lysis 보다 단백질 활성이 중요하기 때문에 detergent의 활성에 대한 영향을

확인해 보는게 좋습니다.

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가나다라abcd  |  2020.12.03 13:52

답변 감사합니다.

제가 너무 기초적인걸 여쭤보느거 같은데 detergent의 활성에 대한 영향은 어떻게 확인해야할까요? ㅠ 감이 잘 잡히지 않네요.. 

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SPEED  |  2020.12.03 14:01
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우선 문헌을 찾아보세요.

실험적으로는 ALP assat 시 +/- triton x-100으로 측정해보면 됩니다.

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가나다라abcd  |  2020.12.03 17:05

감사합니다!

 

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