Q. RNA 분리와 정량
알 animal214 (과기인)  |  2020.12.02 15:56

RNA 정량값이 너무 낮게나와 질문드립니다

 

먼저 RNA isolation시 (Thermo) Trizol을 사용했구요

Trizol 제조자 메뉴얼 그대로 실험을 진행했구요

 

RNA 정량시 (Amersham) ultrospec 2100 pro

사용한 결과 

260 nm 0.065

280 nm 0.047

 

나중에 cDNA 합성시 5ug 정도를 넣어야 하는데 RNA 농도가 너무낮아 희석한것보다 더많은양의 RNA 가 들어가야되는데 뭐가 문제일까요.. 계속해서 컨디션을 잡기위해 몇개씩만 isolation 후 정량을 해보아도 260, 280nm 값 자체가 너무 낮게나오네요.. 고수님들 좀 알려주세요

 

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A. 답변 (1)
A'ANE  |  2020.12.03 17:11

실험 트러블슈팅할때 프로토콜 대로 했다 라고 단정하는건 좋지 않습니다.

 

어딘가에서 기존 실험자들과 다른 부분이 있었기 때문에 결과가 다르게 나온거구요

 

특히 층분리법은 중간층이 Pipeting과정에서 섞이는 경우가 가장 많은데  기 경우 Purity가 매우 낮아지게 됩니다. 그래서 널리 사용되는 Protocol임에도 불구하고 사람손을 매우 많이 타는 RNA추출법이죠.

 

혹은 샘플 자체가 Lysis가 잘 안된경우도 RNA양 자체가 적게 나올 수 있습니다.

 

전처리과정이나, 층분리과정을 다시 진행해 보시면 좋은 결과 있으실 겁니다. 층분리법이 어려우시면 Trizol을 사용하면서 층분리를 안해도 되는 Direct-zol(https://www.zymoresearch.com/collections/direct-zol-rna-kits)같은 제품을 사용하시는것도 좋습니다

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