Q. Real time PCR 시 standard curve
알 coconacoco (과기인)  |  10.27 17:43
안녕하세요 최근 qPCR을 진행중인데 Standard curve가 왔다갔다 거려서 어려움을 겪고 있습니다..
dilution 문제인 것 같은데 제가 하는 실험 방식이 맞는지 확인해주셨으면 좋겠습니다..
어떻게 해야 이 문제를 해결할 수 있을까요?
우선 저는 10^9짜리 standard 5ul를 DW45ul와 섞어 10^8짜리를 만듭니다. 또 그걸 10씩 나눠 분주하여 디퓨리저에서 보관하고, 실험때마다 1개씩 꺼내 10^7, 10^6, 10^5,10^4,10^3,10^2 로 dilution 하여 진행합니다..
문제는 분주된 10^8을 사용하면 10^7 ct값이 늦어집니다. 보통 17, 19로 나와야하는데 21,23, 26.... 이런 식으로 늦어지게 됩니다. 분명 10^9짜리를 10^8으로 dilution하고 바로 10^7~10^2까지 dilution하면 standard curve가 잘 나오는 것 같으면서도.. 얼려진 10^8을 녹여 standard curve를 잡으면 ct값이 전체적으로 늦춰지는 것 뿐 아니라 값이 이리저리 튑니다.. 네.. 아직 기술이 많이 부족하고 제 pipetting 문제라고 생각합니다.. 근데 sample들의 값은 오차가 적습니다.. 또한 다른 분이 dilution한 물질을 가지고 실험했을 때에는 값이 잘 나오더라구요...

제가 dilution하는 것을 지켜보고 다들 같은 방식으로 진행된다고 하시구요.. 저도 다른 분들 실험하는거 계속 보고 관찰하고.. 오히려 제가 vortexing을 하면 더 오래하고 하는데..
standard만 잡으면 잘 잡히다가도 sample이랑 같이 하면 또 엉망으로 됐다가도.. 결과가 이리저리 난리입니다..
잘 나온 날은 제가 10^9를 녹여 standard를 만든 날이더군요...
근데 그렇다고 매번 10^9를 사용할 수도 없는 상황이에요..
10^8을 소분하여 얼려두면 안되는 건가? 싶은데 또 그럴리는 없다고들 하셔서... 답답할 따름입니다..

dilution에 뭐가 문제일까요.. 고수님들 도와주세요..
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