Q. 2.4kb DNA PCR 조건질문드려요 !!
알 감감선 (대학생)  |  10.27 15:26

2.4kb 정도 되는 상대적으로 긴 DNA를 PCR하고 있는 학생입니다 ㅜ

Vibrio genomic 유전자로 PCR를 돌리고 있는데 원하는 2.4kb말고도 그 밑에 잔 밴드들이 4개정도 같이 뜨네요,, 이게 PCR 조건이 잘못돼서 그런건지 궁금합니다 ㅜ

F.primer : 18mer / Tm 59.2

R.primer : 23mer / Tm 57.3

 

Annealing 은 53.2도로 40초 , Extension은 72도로 2분 30초 진행하고

총 35사이클 돌리는데

 

뭐가 문제일까요.. ㅜㅜ 실험 너무 초반부터 막혀서 답답하네요

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A. 답변 (4)
SPEED  |  10.27 15:33

annealing 55도/30초, 57도/45초로 해보세요.

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감감선  |  10.27 15:56

Extension시간은 그대로 해도 괜찮을까요??

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SPEED  |  10.27 16:21

72도는 taq 종류에 따라서 2분~2분30초 사이가 적당할 것 같고 2분 30초면

무난할것 같습니다.

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안재진  |  10.28 11:02

잔 밴드를 줄이는 방법은 Annerling 온도를 조절하는 방법도 있고,

이게 잘 안되면 primer를 1~3개 정도 추가해 보는것도 방법일수 있습니다.

이때 저는 A/T 로 끝나면 G/C가 나온는 부분까지 연장해서 사용합니다.

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