Q. 미생물 배지 제조 시 1차? 3차? 증류수
뒷다리 FoodP (과기인)  |  2018.09.29 17:51
배지분말통에 표기된 비율로 배지 제조하였는데, 표기된 final pH가 6.5인 배지의 pH가 5.3으로 측정되고 배지에서 균이 제대로 자라지 않습니다. 3차 증류수로 배지 제조하였는데 혹시 pH가 낮거나 균이 정상적으로 자라지 않는 이유가 3차증류수를 사용하였기 때문일 수 있을까요? 보통 1차 증류수를 사용하는지 3차 증류수를 사용하는지 궁금합니다..
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A. 답변 (9)
SPEED  |  2018.09.29 18:43
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3차 증류수 및 1차 증류수로 만들어도 무방합니다.

균 배양에서 초기 pH의 영향이 있기는 하지만 pH6.5인 배지가 pH5.3으로 측정되었다고 배양이

안되는 경우는 거의 못본것 같습니다.

만약 초기 pH의 영향인지 알아보려면 배지를 만든 후 멸균 전 pH를 측정하여 또다시 pH5 부근이

나온다면 NaOH로 pH를 6.5로 보정한 후 멸균하여 배양을 해 보세요.

잘 자라면 앞으로 pH 확인 후 배지를 만들어 사용하면 되고 그래도 안자라면 균 자체의 문제일

겁니다.
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Applied_Microbe  |  2018.09.29 20:26
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복합배지의 경우 급할때 수돗물로 만들 기도 합니다. 하지만 일반 수돗물로 배지를 제조할 경우 침전이 생길 수가 있습니다. 수돗물 내의 이온성분들에 영향을 받아서요. 그래서 1차증류수를 사용하시는게 경제적으로도 좋습니다.

그리고 냉동보관된 균이나 냉장고에 오랫동안 방치된 배양액을 계대배양할 목적으로 만든 배지라면 pH의 영향을 받을 수 있습니다.

pH meter는 수시로 보정하시는게 좋고요
그게 불편하시면 사용전에 pH buffer에 담궈서 pH수치를 꼭 확인하세요

균종에 따라서 pH 5.3에서 배양이 안되는 균들도 있습니다.

원래 사용하던 종류의 배지였는데 균이 안자라고, 균의 문제가 아닐 것으로 판단된다면 배지의 로트번호 확인해서 제조업체에 교환요청하세요

참고로 말씀 드리면 배지종류에 따라 다르겠지만 고압멸균 후 pH가 떨어지는 배지들도 간혹 있습니다
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Q.E.D.  |  2018.09.29 23:24
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동물실험에서 동물들에게 물을 줄 때는 수돗물을 끓여서 멸균 한 뒤 식혀서 줍니다.
수돗물에는 잔여 염소 성분들과 수도관과 기타등등으로 세균이 유입되기 때문에
정확한 실험을 위해서 그렇게 해 줍니다.
그럼 왜 동물실험에서는 3차 증류수를 사용하지 않을까요??
그 이유는 생명체가 살아가려면 이온이 필요하기 때문입니다.

우리가 증류수를 사용하는 가장 큰 이유는 이온을 제거하는데 그 목적이 있습니다.
세포실험을 할 때는 이 이온성분들이 방해가 되기 때문에 꼭 제거를 한 3차 증류수를 
베이스로 만든 시약이나 배지들을 가지고 실험을 해야 합니다.

그렇다면 세균의 경우는 어떨까요?
세균은 혼합 오염의 위험을 제거하기 위해 1차 증류수를 사용해야 하며
세균 역시 이온이 필요하기 때문에 3차 증류수를 사용하는건 좋지 않습니다.
그러므로 세균 배지는 1차 증류수를 사용하세요~~

그리고 pH는 온도에 의해서, 보관 상태에 따라서,
기타 등등의 이유로 자주 변하기 때문에
6개월에 한 번씩 점검을 받아주는게 좋습니다. 

균주에 따라서 pH영향을 많이 받는 경우가 있으니까
윗 분들 말씀처럼 pH 보정을 해서 새로 배지를 제작해서
균주를 접종 해 보시구요, 그래도 안 자란다면 배지나 균주 자체의 문제일 수도 있습니다.

추가로
[일반적인 균주라면 동결건조 앰플 상태에서 -20도에서 오래 생존하고
-196도 vial 상태라면 그 보다 더 오래 생존이 가능하지만
균주에 따라서 동결건조 앰플 상태에서 몇년밖에 생존이 불가능 한 경우도 있습니다.
그렇기 때문에 특이한 균주를 사용하고
그걸 받아서 푸는 경우라면 그런 문제도 살피셔야 합니다.
그렇게 유난떠는 균주라면 동결건조 앰플을 100~300ul의 용매로 녹일때
saline의 염 성분이 균주에게 쇼크를 줄 수 있어서
DW로 풀어주는게 생존률을 조금 더 올릴 수 있습니다.]
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Applied_Microbe  |  2018.09.30 00:29
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배지 제조시 3차증류수 사용해도 무방합니다
그 이유는 배지의 성분들에 이미 포함되어있는 필수이온과 함께 배지 성분자체의 불순물이 trace element로 작용합니다
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SPEED  |  2018.09.30 00:40
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저 또한 Applied_Microbe님과 같은 의견입니다.

미생물 배양의 경우 3차수, 1차수 모두 무방하다고 생각하며 실제로 25년 넘게 미생물 배양을

해 왔기 때문에 경험상으로도 별 문제가 없었습니다.

그리고 미생물 배양에 필수적으로 이온이나 미네랄이 요구되는 상황이면 배지 조성에 요구되는

성분을 포함하여 탄소원, 질소원이 구성되어 있기 때문에 이온이 거의 제거된 3차수도 미생물

배양에는 별 문제가 없습니다.
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Q.E.D.  |  2018.09.30 02:00
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제가 좀 잘못 알고 있었나 봅니다 ^ ^
전에 세균을 분양해주는 균주은행에서 근무한 적이 있었는데
3차 증류수로 배지를 만들었다가 혼난적이 있어서요 ㅋㅋ

1차, 3차 모두 균주들이 자라기는 하지만
1차보다 3차 증류수일 때 덜 자랐던 적도 있어서
두 경우를 종합해 그런줄 알고 있었는데 ㅜ.ㅜ
두 분 덕분에 다시 한 번 레퍼런스를 찾아 봐야 겠네요~ 감사합니다.
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FoodP  |  2018.09.30 18:56

신설된 실험실이라 배울 곳이 많이 없었는데, 질문 등록할 때마다 친절히 답변해주셔서 SPEED 포함한 모든 분들에게 감사합니다. 큰 도움 되었습니다~! 저는 FINAL pH 를 멸균한 후에 측정되는 pH 라고생각했는데 그게 아니었군요 다시만들어서 확인해보겠습니다~!

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Q.E.D.  |  2018.10.01 17:44
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위 부분이 궁금해서 Difco & BBL 제품을
국내에 판매하는 BD사를 통해 본사에 문의를 드리니
1차 3차 증류수 모두 사용이 가능하지만
3차 증류수의 경우, 유기물 및 이온이 많이 제거된 상태라
균의 생장에 영향을 줄 수도 있다는 답변을 받았습니다.
그러니 되도록이면 1차 증류수를 사용하세요^^
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안재진  |  2018.10.04 17:09

미생물 배지 제조에는 정제수를 쓰라 되어 있습니다.
여기서 말하는 정제수는 RO수 급 이상(물론 초순수정제수 포함)을 말합니다.
약전에서는 2.1㎲/㎝  이하의 전도도를 가지는 물을 말합니다.

위에 이온 문제를 말씀하시는데 peptone이나 agar에는 상당한 이온 물질들이 있습니다.
미생물이 요구하는 이온들은 배지를 녹이면서 충분히 공급받을수 있습니다.

따라서 초순수만 된다 RO수만 된다보다는 정제수(RO)급 이상이면 다 된다면 맞을것 같습니다.


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